近期，耶魯大學醫(yī)學院的研究人員利用TissueFAXS Cytometry系統(tǒng)完成免疫細胞原位表征的定性定量分析的文章，成功刊登在澳洲生物學網(wǎng)站News Medical上并且迅速登上Google搜索第一名的位置。

如今，由于單細胞成像和定量分析技術的迅猛發(fā)展，人們已經(jīng)可以做到在組織原位中檢測免疫細胞。 但是，基于傳統(tǒng)熒光成像的顯微觀測技術受限于可見光光譜范圍，通常只能同時標記、檢測四種生物標志物，從這個角度來說，我們對于細胞狀態(tài)的理解仍然不全面。

借助于流式細胞術，人們可以在液流中同時檢查多個染色的生物標志物，但它也會丟失細胞原始的形態(tài)結構，以及與其組織有關的微環(huán)境信息（tissue microenvironment）。

因此，建立一種既可以提供多細胞生物標志物的數(shù)據(jù)信息，同時又保留組織細胞微環(huán)境信息的技術（就像常規(guī)顯微鏡一樣），在滿足當代臨床科研的嚴格要求方面，將具有很大優(yōu)勢。

實驗概述

實驗樣本來自Marcus Bosenberg博士開發(fā)的黑色素瘤小鼠模型中脾臟的組織樣本，由本文作者Kim Blenman博士分離出小鼠脾臟。Blenman使用福爾馬林固定石蠟包埋的脾臟組織切片，利用Cy3和Cy5染料染色，并進行了熒光顯微成像觀察。Blenman主要關注點在于CD4跨膜蛋白（多種T細胞亞型的生物標記物）以及六種其他細胞活性的標志物——包含與這些細胞相關的增殖和轉錄功能。

本實驗利用了多輪染色技術，在每一輪染色之間，使染料失活，這樣可以獲得細胞上的不同生物標志物的染色情況，例如Foxp3，Granzyme B，IL-6，Ki-67，RORγ（t）和T-bet。

 Blenman博士所做的這種多輪染色技術，其實是TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry全景組織細胞定量分析技術一個應用分支。利用該技術，不但可以獲得每輪染色的高倍率全景圖像，更重要的是可以把每輪染色圖像進行擬合，獲得組織原位單細胞多重染色標記的圖像后，再利用StrataQuest軟件分析。

該技術首先利用一種算法將拼接好的全景圖像擬合在一起，從而重新創(chuàng)建一個合成圖像，包含每輪染色回合中的單個細胞每個通道的生物標記信息。在每個通道的單細胞識別層面，StrataQuest軟件生成的虛擬影像中，采用兩種不同的模式進行識別：一種用來識別細胞核，另外一種用于鑒定細胞表型的生物標記。隨后，通過確定目的蛋白的陽性率，最終而完成整個定量分析。

在定量分析過程，使用的是“Backgating”反向回溯功能。根據(jù)原始圖像中信號表達的微小差異，精準確定cutoff線閾值的設置位置，進而區(qū)分陰陽性細胞。類似于流式細胞技術中從直方圖或散點圖中“gating”設門圈選功能，但是可以做到反向“gating”在原始圖像中實時校驗圈選的范圍與結果。

Blenman博士將其用于脾臟組織樣本，證實一次就可以在組織原位單細胞水平獲得多種生物標志物信息。根據(jù)細胞個體和簇表達的生物標志物的不同組合，將這些細胞歸類。通過這種方式，Blenman團隊證明了細胞簇中CD4表達的水平與生物標志物表達的模式、細胞增殖之間的關聯(lián)。

預見未來

免疫系統(tǒng)是異常復雜的，傳統(tǒng)熒光顯微成像針對每個細胞只能分析四種生物標志物，對于免疫方向的研究是一個極大的限制。而TissueFAXS Cytometry的多輪多重染色標記技術，以常規(guī)顯微成像為基礎，不但可以使用實驗室常規(guī)染料，染色技術也無需特殊培訓，非常易于使用。盡管本文作者此次分析了6種生物標志物，但理論上講，同時分析生物標記物的數(shù)量是沒有限制的。

Blenman博士指出，這種方法的優(yōu)勢在于能夠在單細胞水平多標記、客觀地量化細胞生物標志物。因為針對個體疾病及其潛在機制的靶向治療的數(shù)量有所增加，該方法在癌癥治療中也是非常有效的（ Cytometry Part A）。

該方法具備流式細胞術的設門圈選功能，但額外提供反向回溯和散點圖直方圖數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式的功能，同時又可以保留空間位置信息。

TissueGnostics的創(chuàng)新

Blenman博士應用TissueGnostics公司TissueFAXSCytometry技術，成功將文章發(fā)表在Cytometry Part A 雜志上。該技術兼顧高效，高自動化的工作流程，同時可以與MATLAB腳本整合。此外，還可提供50多個針對特定研究方向的APP（數(shù)量還在不斷增加）。 每個APP都可以提供完善的分析工作流程，并提供多種數(shù)據(jù)報告形式。

TissueFAXS Plus是一款高兼容性的正置系統(tǒng)，能夠掃描和分析細胞涂片，玻片，涂片和TMA樣本。除常規(guī)配置外，支持多種形式定制（共聚焦/多光譜/高通量/全自動顯微工作站等）。

同時可選配以下三個軟件之一，HistoQuest，TissueQuest和StrataQuest。StrataQuest是其中的分析軟件。StrataQuest可以自動識別特定組織結構（例如血管/神經(jīng)/腺體/腫瘤等），并可以識別和定量細胞樣本中的所有個單細胞。取決于全景虛擬切片的大小，一個樣本中可以定量分析的單個細胞數(shù)量，在數(shù)萬個到數(shù)千萬個細胞不等，遠遠高于其他單細胞定量分析系統(tǒng)。

References

Blenman KRM &Bosenberg MW. Immune Cell and Cell Cluster Phenotyping, Quantitation, andVisualization Using In Silico Multiplexed Images and Tissue Cytometry.Cytometry A. 2019; 95:399-410. doi: 10.1002/cyto.a.23668.

News Medical(2018). Image Cytometry Technology and Tissue Analysis. Available at:https://www.news-medical.net/news/20180904/Image-Cytometry-Technology-and-Tissue-Analysis.aspx.Accessed: Aug 2019.