挫傷是日常生活中最常見的一類機(jī)械性損傷，其損傷時(shí)間推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。 損傷時(shí)常伴隨骨骼肌挫傷，局部出現(xiàn)紅、腫、熱、痛和功能障礙。挫傷早期，在受損部位炎癥因子的趨化作用下，中性粒細(xì)胞從血管滲出并向壞死部位定向趨化移動，吞噬和清除壞死組織， 從而為損傷區(qū)組織修復(fù)和再生創(chuàng)造條件。因此，中性粒細(xì)胞對于早期損傷時(shí)間推斷具有重要研究價(jià)值。

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)建立大鼠損傷模型，并在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)從對照組和實(shí)驗(yàn)組獲得骨骼肌樣品。通過蘇木精和伊紅（HE）染色和免疫組化（IHC）染色檢測細(xì)胞核和中性粒細(xì)胞的表達(dá)。然后在所有時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇20個(gè)0.25mm2（0.5mm×0.5mm）的受傷部位進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用TissueFAXS 200數(shù)字病理分析系統(tǒng)快速，準(zhǔn)確地識別了挫傷骨骼肌再生過程中的MPO標(biāo)記的中性粒細(xì)胞，對中性粒細(xì)胞在骨骼肌損傷 后的浸潤過程進(jìn)行定性、定位、定量分析，同時(shí)應(yīng)用組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)，檢測中性粒細(xì)胞在炎癥階段的浸潤面積，以評估損傷時(shí)間。

該文章2020年3月發(fā)表在Forensic Science Research。

實(shí)驗(yàn)方法

利用TissueFAXS 200數(shù)字病理分析系統(tǒng)在骨骼肌挫傷再生過程中識別中性粒細(xì)胞，以免疫組化樣本的染色強(qiáng)度和染色面積作為參數(shù)識別細(xì)胞核，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不同的核面積參數(shù)，逐步優(yōu)化細(xì)胞核識別數(shù)量。并使用ROC曲線分析確定染色區(qū)域的cut-off值。研究通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)標(biāo)記 MPO 以特異性識別中性粒細(xì)胞。（本文章中所有圖像獲取及分析結(jié)果均來自TissueFAXS 200系統(tǒng)）

圖1 篩選有效細(xì)胞核并計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞

首先，利用 StrataQuest軟件對明場拍攝的IHC樣本中蘇木素和DAB染色通道進(jìn)行拆分，通過蘇木素通道識別細(xì)胞核后，利用著色的細(xì)胞核強(qiáng)度和細(xì)胞面積作為參數(shù)，排除黏連細(xì)胞及細(xì)胞碎片；繼而，以細(xì)胞核為核心尋找胞質(zhì)范圍內(nèi)存在的DAB染色陽性區(qū)域，通過 DAB 顯色強(qiáng)度和著色面積作為參數(shù)，對陽性中性粒細(xì)胞進(jìn)行識別篩選。     

在篩選陽性中性粒細(xì)胞的過程中，調(diào)節(jié)DAB染色面積的cut-off線，獲得不同陽性率數(shù)值。結(jié)合TissueGnostics公司的正反向回溯追蹤功能，可以實(shí)時(shí)獲得不同篩選標(biāo)準(zhǔn)下的量化標(biāo)準(zhǔn)；隨后，由5名病理學(xué)專家對相同樣本進(jìn)行判定獲得肉眼讀片數(shù)據(jù)，作為比較的基準(zhǔn)；最后，將兩者數(shù)值相比，得到染色面積cut-off值的假陽性（FP）和假陰性（FN）數(shù)量，敏感性，特異性和ROC曲線等數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1 骨骼肌組織樣本

圖2 挫傷后骨骼肌和對照組的HE染色樣本

2 TissueFAXS 200數(shù)字病理分析系統(tǒng)重復(fù)性驗(yàn)證

將0.25mm2（0.5mm×0.5mm）（n = 20）的20個(gè)受傷部位隨機(jī)分配，并重復(fù)進(jìn)行9次測試。 重復(fù)測試給出的結(jié)果相似，變異系數(shù)（CV）為0％，表明該儀器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 

3 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌細(xì)胞核的識別和定量

在StrataQuest軟件中自動識別蘇木素和DAB染色區(qū)域后，通過染色面積和平均強(qiáng)度在不同調(diào)節(jié)染色面積cut-off值識別細(xì)胞核和中性粒細(xì)胞。

圖3 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌細(xì)胞核的識別和定量

A 蘇木素染色免疫組化樣本

B 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞核表達(dá)散點(diǎn)圖 

C 圖（A）陰性對照組分析區(qū)域散點(diǎn)圖

D 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞核表達(dá)

4 不同cut-off值的中性粒細(xì)胞的表達(dá)

圖4.不同的染色面積cut-off值嗜中性粒細(xì)胞的變化。

中性粒細(xì)胞在組織損傷后早期階段炎癥情況和估計(jì)損傷時(shí)間中起著重要作用。

A 在染色區(qū)域的不同cut-off值中性粒細(xì)胞數(shù)目變化的散點(diǎn)圖；

B 同區(qū)域中，隨著染色區(qū)域的cut-off值增加，預(yù)測陽性的數(shù)目減少而預(yù)測陰性的數(shù)目增加； 

C 隨著染色區(qū)域的cut-off值增加，觀察到的假陽性的數(shù)目減少而假陰性的數(shù)目增加； 

D 隨著染色區(qū)域的cut-off值增加，真陽性的數(shù)目減少而真陰性的數(shù)目增加。

5 不同損傷時(shí)間中性粒細(xì)胞的相對表達(dá)

當(dāng)染色區(qū)域的cut-off值為12μm2時(shí)，使用TissueFAXS 200數(shù)字病理分析系統(tǒng)檢測免疫組化圖像中性粒細(xì)胞的數(shù)量和百分比。計(jì)算每個(gè)受傷區(qū)域的MPO陽性中性粒細(xì)胞相對于細(xì)胞核總數(shù)的平均比率。

通過TissueFAXS 200全景組織細(xì)胞高通量定量分析系統(tǒng)，使用基于圖像的定量分析方法，以及整合的傳統(tǒng)病理讀片判定標(biāo)準(zhǔn)，可以建立具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，以及更為客觀精準(zhǔn)的定量分析流程。在法醫(yī)病理，疾病預(yù)后，治療效果評估等等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。